熊果酸对大鼠脑缺血再灌注损伤后线粒体保护作用的研究

[摘要] 目的: 研究熊果酸对大鼠脑缺血再灌注后脑线粒体的保护作用。方法: 采用线栓法制备局灶性脑缺血再灌注大鼠模型，设假手术组、模型组和熊果酸80mg/kg组，各20只，分别于术前10min腹腔注射给药。24h后，测定缺血侧脑线粒体膜流动性、呼吸功能。结果: 与模型组比较，经熊果酸80mg/kg组治疗能够明显提高大鼠脑缺血后线粒膜流动性，改善线粒体呼吸功能。结论: 熊果酸对脑缺血再灌注后脑线粒体损伤具有一定的保护作用。

  [关键词] 熊果酸；脑缺血；线粒体；呼吸功能

能量耗竭及氧自由基代谢障碍是缺血性脑损伤的主要病理机制^[1]，线粒体为能量代谢及自由基产生的主要场所，而线粒体又是缺血性脑损伤主要亚细胞器靶目标。熊果酸是一种具有多种药理作用的五环三萜类化合物，本实验以线粒体为研究对象，探讨熊果酸对缺血性脑血管病的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物  清洁级SD大鼠购自河北医科大学实验动物中心[SCXK（冀）2013-1-003]，适应性饲养1周后进行实验。

1.2 药物与试剂  熊果酸购自陕西慧科植物开发有限公司；线粒体分离试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.3 实验方法

1.3.1 分组与模型制备  取60只试验用大鼠按照随机数字表法随机分为假手术组、模型组和熊果酸80mg/kg组，每组20只。采用线栓法阻断大脑中动脉2h的方法制备局灶性脑缺血再灌注大鼠模型。术前10min腹腔注射给药，假手术组和模型组给予生理盐水。

1.3.2 线粒体的制备^[2]  脑缺血24h后，实施麻醉、断头取脑，分离缺血侧大脑组织，置于预冷（4℃）的组织裂解液中，制备10%脑组织匀浆液，3000rpm低温（4℃）离心5min后取上清液，12000rpm低温（4℃）离心10min后，弃上清液取沉淀，即为线粒体，考马斯亮蓝测定蛋白含量。

1.3.3 线粒体膜流动性测定  采用荧光偏振度法^[3]：参照1.3.2法制备浓度为1.00g线粒体蛋白/L悬液，取1ml线粒体悬液加入3ml二苯基己三烯溶液（2μmol/L），25℃温水浴30min后测定荧光偏振度K（激发波长362nm，发射波长432nm），微粘度η=2K（0.46-K）；膜流动性用荧光偏振度K、微粘度η表示，微粘度越大，膜流动性越小。

1.3.4 线粒体呼吸功能的测定  采用改良Clark氧电极法：取1mg蛋白量线粒体加人2.5ml反应介质中，30℃恒温孵育1min后加入20μL底物，然后描记呼吸曲线。2min后加人10μL 腺苷二磷酸（ADP，45 mmol/L），连续描记III态（R3）快速耗氧及ADP完全磷酸化后的IV态（R4）耗氧曲线，R3、R4耗氧速率比值为呼吸控制率（RCR）。

1.4 统计学处理  运用软件SPSS13.0进行统计分析，计量资料以表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组大鼠脑缺血再灌注后脑线粒体膜流动性  与假手术组比较，模型组脑缺血大鼠缺血侧脑线粒体荧光偏振度K值、微粘度η值显著升高（P<0.01），提示脑线粒体膜流动性明显降低；而与模型组比较，熊果酸组脑缺血大鼠缺血侧脑线粒体K值、η值显著降低（P<0.05或P<0.01），提示熊果酸具有提高脑缺血大鼠缺血侧脑线粒体膜流动性的作用。结果见表1。

表1  熊果酸对大鼠脑缺血再灌注后脑线粒体膜流动性的影响（）

注：与假手术组比较：^**P<0.01；与模型组比较：^△P<0.05, ^△△P<0.01

2.2 各组大鼠脑缺血再灌注后脑线粒体呼吸功能  与假手术组比较，模型组脑缺血大鼠缺血侧脑线粒R3值显著降低、R4值显著升高、RCR显著降低（P<0.01）；而与模型组比较，熊果酸组脑缺血大鼠缺血侧脑线粒体R3值显著升高、R4值显著降低、RCR显著升高（P<0.05或P<0.01），提示熊果酸具有改善脑缺血大鼠缺血侧脑线粒体呼吸功能的作用。结果见表2。

表2  熊果酸对大鼠脑缺血再灌注后脑线粒体呼吸功能的影响（）

注：与假手术组比较：^**P<0.01；与模型组比较：^△P<0.05, ^△△P<0.01

3 讨论

本实验研究发现，经熊果酸预处理能够有效提高大鼠脑缺血再灌注后缺血侧脑线粒体膜流动性、提高线粒体呼吸功能，提示熊果酸对脑缺血后脑线粒体具有一定的保护作用。

参考文献

1. 颜娟，郑茂东，崔玉环, 等. 牡荆苷对脑缺血再灌注损伤小鼠脑组织能量代谢的影响[J]. 山东医药, 2017, 57(5): 26-29.

2. Zhang HX, Du GH, Zhang JT. Ischemic pre-conditioning preserves brain mitochondrial functions during the middle cerebral artery occlusion in rat[J]. Neurol Res, 2003, 25: 471-476.

3. Xiong J, Feng YP. The protective effect of butylphthalide against mitochondrial injury during cerebral ischemia[J]. Acta Pharm Sin, 2000, 35(6): 408-412.